PCR چیست ، کاربردPCR چیست؟

PCR چیست؟

PCR به علت دارا بودن ویژگی وحساسیت بالا وسرعت وسهولت آن جایگاه ویژه ای درتحقیقات وتشخیصهای مولکولی پیدا کرده است.

PCR درسال1983توسط دکترMullis ابداع شد،که جایزه نوبل شیمی رادرسال1993 دریافت کرد.

PCR در محیط آزمایشگاه(in vitro) امکان تکثیریک توالی معین ازDNAراکه بین دوتوالی مشخص قراردارد امکان پذیرمی کند تا DNA ازنظرمقدار به حدکافی برسد وبتوان روی آن آزمایشهایی مثل الکتروفورز-ژل آگارز- پلی اکریل آمید،هیبریداسیون باپروب راانجام داد.این روش ازنظرعلمی تشابه زیادی به همانندسازی DNA دارد.دکترMullis اولین بار ازآنزیمDNA پلیمراز اشریشیا کولی برای انجام PCR استفاده کرد.

یک نمونه از دستگاه PCR

کاربردPCR

تعین جنسیت جنین،تعیین ژنوتیپ اپیتوپهای پیوندی ،تعیین ژنوتیپ گروههای خونیABO ،تهیه نسخه های متعدداز یک ژن،تشخیص بیماریها واختلالات ژنتیکی ،تشخیص بیماریهای عفونی ،ردابوت وتعیین والدین مطالعات باستان شناسی ،تعیین انواع لوسمیها ،تولیدوطراحی واکسنهای انسانی ودامی ،پزشکی قانونی وانگشت نگاری،DNA ازروی لکه خشک شده خون ،درتشخیص HIV ،سل وبیماریهای مقاربتی.

درحقییقت این تکنیک می رود تا دراینده نتیجه گیری دادگاهها راتحت تأثیرقراردهد.

دانشمندان اکنون می توانند میکروارگانیسمهای غیرقابل کشتی راکه تا کنون نمی توانستند با روشهای کلاسیک میکروب شناسی مورد مطالعه قراردهند به کمک PCR مطالعه نمایند.

نمونه های مورداستفاده برای آزمایشگاه مولکولیPCR

طیف وسیعی ازمواد بیولوژیک ،لکه های خون،سرم،بزاق،منی ،مو ،مایع نخاعی ،استخوان، مایع آمنیون،سلولهای خودجنین درمرحله بلاستولا ،نمونه های بیوپسی ویا آتوپسی باشند هرچه آلودگی کمترباشد حساسیت ودقت نتایج بیشتر خواهد بود.

PCR چیست ، کاربردPCR چیست؟

اصول وروشهای PCR

روش PCRبرمبنای سه روش ساده بنا شده که انجام این سه مرحله درهرواکنش سنتز DNA ضرورت داردکه با برنامه دادن به Thermocycler اجرا می شود وعبارتند از:

1- مرحله Denaturation: دراین مرحله DNA هدف براثرحرارت تک رشته ای می شود،حرارت90-95 درجه سانتیگراد

-2مرحله Annealing : دراین مرحله با کاهش حرارت سیستم ،پرایمرها درمحل مناسب روی رشته مکمل متصل می شوند ،دما53-75 درجه سانتیگراد، درمرحله Anneling بایددقت لازم بعمل آیدودما باید به درستی انتخاب شود این کار توسط کامپیوتر به طور مستقیم ویا توسط محقق وبا توجه به دانش فنی وتجربه صورت می گیرد اگردمای Annealing بدرستی انتخاب نشود احتمال تکثیر غیراختصاصی DNAوجوددارد به طوری که دردمای پایینتراز حداستانداردAmplication غیراختصاصی ودر دمای بالاتر ازمعمول عدم تکثیرDNA رخ می دهد.

-3مرحله Extension : در این مرحله که دمای آن برای انزیم DNA پلیمراز مطلوب می باشد موجب توسعه پرایمرها شده وهمانندسازی DNA هدف انجام می گیرد.دما حدود72 درجه سانتیگراد آنزیم مقاوم به حرارت Taq polymerase چهارتا نوکلئوتید dATP ، dGTP ،dTTP، dCTP موجود درمحیط وبافرهای PCR شامل Tris وپرایمرهای جفت شده به DNA را درحضورMgcl2 مورداستفاده قرار می دهد و واکنش پلیمریزاسیون را کاتالیز می نماید وسبب طویل شدن رشته DNA جدیدی که توسط پرایمر ساخته شده است می شود . PCR چیست ، کاربردPCR چیست؟

نتیجه چرخه سه مرحله ای فوق سنتز دو مولکول جدیدDNA است ،سنتز DNA جدید به صورت تصاعدی آنقدر ادامه می یابد تا اینکه یکی ازمواد تشکیل دهنده محیط واکنش کاهش یابد وغیرفعال شود. به طورکلی حدود35-25 سیکل کافی است تا ازمقدار بسیارکم DNA صدها هزارنسخه DNA سنتز گردد. ازنظرتئوری بعداز20 سیکل 1میلیون وبعداز 30سیکل 1میلیارد کپی حاصل می گردد.نکته ای که درمراحل مختلف PCR بایدمورد توجه قرارگیرد زمان لازم برای رسیدن ازیک دما به یک دمای دیگرکه زمان کوتاهی است (Ramping Time).