دستگاه HPLC و کاربرد HPLC چیست

دستگاه HPLC

کروماتوگرافی روشی است برای تشخیص و جدا سازی و اندازه گیری مواد HPLC یعنی کروماتوگرافی مایع با فشار زیاد یا کروماتوگرافی مایع با کارکرد عالی است.

HPLC از دو فاز ثابت و متحرک تشکیل شده است. که فاز ثابت جامد و فاز متحرک مایع است.

اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه HPLC

۱- مخازن محلول

که در آنها فاز متحرک و یا محلول های شستشو دهنده ستون ریخته شده است.

۲- موتور یا پمپ:

چون ستونها نسبتا طویل و اندازه ذرات کم است. به این جهت قابلیت نفوذ کم می شود و برای این که محلول جریان داشته باشد باید فشار وجود داشته باشد. برای ایجاد فشار از پمپ ها استفاده می کنیم. پمپ فشاری حدود psi ۴۵۰۰ می تواند ایجاد کند و باید فشار آن ثابت باشد. دستگاه HPLC و کاربرد HPLC چیست

محلول توسط پمپ با جریان ثابتی بر روی فاز ثابت حرکت داده می شود. حداکثر جریانی که فاز متحرک می تواند داشته باشد ۲،۵ملی لیتر در یک دقیقه است. و نظر به نوع کاری که می خواهیم انجام دهیم فلو یا جریان فرق می کند. هر چه جریان کمتر باشد، فاصله پیک ها بیشتر است.

میزان فشار بستگی به جریان دارد وقتی جریان ml/min ۰.۸ است میزان فشار حدود psi ۱۵۰۰ می شود.

میزان فشار بستگی به نوع ستون دارد حداکثر فشار مجاز Psi ۳۵۰۰ است. حداکثر تغییرات فشار Psi ۱۰۰ است. حداکثر فلوریت Flow rate ، ml/min ۲.۵ است. پس پمپ، محلول را از مخزن می گیرد و با سرعت معین آن را بداخل دستگاه وارد می کند.

به دو روش می توانیم کار کنیم:

الف: روش ایزوکراتیک isocratic

اگرنسبتهای مختلفی ازفاز متحرک را دریک مخزن بریزیم و ازهمان مخزن فازمتحرک را برداشت کنیم ازروش ایزوکراتیک استفاده کرده ایم.

ب: روش گرادیانت gradient :

اجزاء فاز متحرک در مخازن مختلف قرار دارند.

دستگاه قابلیت این را دارد که خودش نسبت های مختلف را از مخازن برداشت کند، مثلا می خواهیم ازمخزن اول ۸۰ فیصد از مخزن دوم ۸ فیصد و از مخزن سوم ۱۲ فیصدبکشد و بعد نسبت ها را مخلوط می کند. از این روش وقتی استفاده می کنیم که نسبت های موردنظر را نمی دانیم و بخواهیم روش کارپیدا کنیم. ولی وقتی درصد فاز متحرک برای ما روشن شد می توانیم از روش ایزوکراتیک استفاده کنیم. فاز متحرک با جریان ثابتی بر روی ستون حرکت داده می شود. دستگاه HPLC و کاربرد HPLC چیست

حداکثر فلو یا جریان در این تجربه ml/min0.۸ یا ۱ است.

بعد از فعال کردن هر پمپ flow rate را از کم به زیاد کم کم بالا می بریم تا حدود ml/min  ۰.۸ یا ۱ و می گذاریم حدود پانزده دقیقه یا نیم ساعت با فلوریت بالا کار کند و بعد فلوریت را به تدریج پایین می آوریم تا صفر و بعد پمپ را عوض می کنیم. یا دستگاه را خاموش می کنیم، فلوریت که بالا برود فشار هم بالا می رود. بعد از اتمام کار ستون را با محلول های شستشو دهنده می شوئیم. محلول های شستشو را در مخازن ریخته و پمپ ها را به ترتیب فعال می کنیم اول دستگاه را با آب و متیانول شسته و سپس با متیانول خالص می شوئیم. هر پمپ را که فعال کردیم باید ابتدا هوا گیری کنیم.

۳- انجکتر injector:

از سوزن های مختلف با ظرفیت های مختلف استفاده می کنیم.

حجم تزریق ۳- میکرولیتر است.

دستگاه HPLC و کاربرد HPLC چیست

نمونه ابتدا وارد قسمتی بنام گارد کالوم یا پری کالوم میشود که محافظ ستون است، طول کاردکالوم حدودیک سانتیمتر است.

و جنس آن از فولاد ضد زنگ است، و ماده پرکننده آن از جنس ماده پرکننده ستون است.

اگرماده موردتشخیص ناخالصی داشته باشد یابا ماده داخل ستون عملیه کیمیاوی ایجادکند درگاردکالوم انجام میشود وبه ستون آسیبی نمی رسد.